Cytoskeleton，Inc。很高興為藥物篩選，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞骨架研究提供廣泛的試劑盒和產(chǎn)品。我們專注于生產(chǎn)純化蛋白質(zhì)和易于使用的試劑盒，以研究生物化學(xué)和細胞過程。我們的試劑盒可用于少量樣品，用于基礎(chǔ)研究或小屏幕（Biochem Kits™），也可用于大屏幕的高通量樣品（CytoDYNAMIX Screens™）。

除了我們現(xiàn)有的產(chǎn)品，我們還在產(chǎn)品線中為微管，微管蛋白，運動蛋白，小G蛋白效應(yīng)物，GAP，GEF和其他幾種蛋白提供藥物篩選服務(wù)。

Cytoskeleton的Biochem Kits™是用于分析細胞骨架生物化學(xué)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同方面的綜合試劑盒。這些工具包通常構(gòu)成出版物中圖形的基礎(chǔ)，請查看引文標簽中的示例。該試劑盒附帶了分析所需的所有試劑以及如何使用它們的詳細說明，因此您可以在準備好試劑盒后立即進行分析！

· 測量蛋白質(zhì)和藥物對肌動蛋白聚合/解聚的影響。

· 發(fā)現(xiàn)和表征肌動蛋白結(jié)合蛋白（ABPs）。

· 在細胞或組織裂解物中定量G-肌動蛋白（單體）對F-肌動蛋白（聚合物）。

· 將設(shè)置時間從幾個月縮短到幾天。

許多出版物引用了在論文的材料和方法部分中使用Cytoskeleton的試劑盒。通常，引文與圖形或圖像形式的特定結(jié)果相關(guān)聯(lián)，這有助于您，作者，您的發(fā)現(xiàn)。這表明套件可在短時間內(nèi)生成出版物質(zhì)量數(shù)據(jù)，從而有助于提高工作效率。肌動蛋白試劑盒的引用示例如下所示。個別產(chǎn)品頁面上提供了更多引文。??

問題1：哪種試劑盒是檢測肌動蛋白結(jié)合蛋白的*選擇？ 

答案1：  Cytoskeleton有兩個肌動蛋白結(jié)合蛋白旋轉(zhuǎn)分析試劑盒，是識別和表征肌動蛋白結(jié)合蛋白的理想選擇。一個試劑盒使用肌肉肌動蛋白（Cat。＃BK001），另一個試劑盒使用非肌肉肌動蛋白（Cat。＃BK013）。兩種測定均利用共沉淀來鑒定蛋白質(zhì)是否與單體或絲狀肌動蛋白結(jié)合以及蛋白質(zhì)是否具有F-肌動蛋白切斷或成束特性。為了檢查與肌動蛋白單體結(jié)合的化合物或蛋白質(zhì)，含有鏈霉抗生物素蛋白包被的孔的96孔板可以與生物素化肌動蛋白復(fù)合（Cat。＃AB07）產(chǎn)生肌動蛋白單體捕獲蛋白。然后可以將化合物，蛋白質(zhì)或提取物與捕獲蛋白一起溫育，并且可以通過HRP檢測系統(tǒng)使用針對目標化合物或蛋白質(zhì)的抗體（或標記可以與測試蛋白綴合）來顯現(xiàn)結(jié)合。請記住，緩沖液組成也很重要，因為它需要低鹽（約50 mM）并含有CaCl 2（或其他二價陽離子）和ATP以維持肌動蛋白單體的穩(wěn)定性。有關(guān)兼容緩沖液的示例，請參閱我們的一般肌動蛋白緩沖液配方（Cat。＃BSA01-001）。或者，可以用GST標記感興趣的蛋白質(zhì)（避免還原劑）并與板綴合，然后與生物素化的肌動蛋白一起溫育，并用HRP綴合的鏈霉抗生物素蛋白顯現(xiàn)。

問題2：當(dāng)我對感興趣的肌動蛋白沒有可用的芘結(jié)合物（例如心臟，平滑肌或細胞質(zhì)肌動蛋白）時，如何用芘測定法測量肌動蛋白聚合？ 

答案2：  為了檢查未標記肌動蛋白的聚合，請點擊此處查看使用過量未標記肌動蛋白（心肌，平滑肌或細胞質(zhì)）加10％芘標記肌肉肌動蛋白的聚合方案。芘肌肉肌動蛋白不會以該測定中使用的濃度自身聚合，因此反應(yīng)依賴于未標記的非肌肉肌動蛋白形成F-肌動蛋白。以這種方式，芘標記的肌肉肌動蛋白被吸收并聚合以充當(dāng)用于聚合未標記的肌動蛋白的報道分子，其以更高的濃度存在。

問題3：如何從細胞或組織提取物中測量G-和F-肌動蛋白？ 

答案3：  確定細胞或組織樣本中游離球狀肌動蛋白（G-肌動蛋白）含量與絲狀肌動蛋白（F-肌動蛋白）含量的可重復(fù)和準確的方法是使用F-肌動蛋白和G-肌動蛋白部分的Western印跡定量。 。一般方法是使F-肌動蛋白穩(wěn)定緩沖液中的細胞或組織均質(zhì)化，然后高速離心以將F-肌動蛋白與G-肌動蛋白池分離。然后通過SDS-PAGE分離級分，并通過Western印跡定量肌動蛋白。終結(jié)果給出了準確的方法來確定摻入細胞骨架的F-肌動蛋白與細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的G-肌動蛋白的比例。細胞骨架提供了一種簡單易用的選擇，可用G-肌動蛋白/ F-肌動蛋白體內(nèi)檢測試劑盒（Cat。＃BK037）定量G-和F-肌動蛋白。該試劑盒提供了在不同處理條件下定量細胞或組織樣品中單體和聚合肌動蛋白水平的所有必需試劑。將樣品離心，然后將沉淀（F-肌動蛋白）和上清液（G-肌動蛋白）溶解于SDS上樣緩沖液中并通過Western印跡處理。 

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肌動蛋白結(jié)合蛋白旋轉(zhuǎn)分析Biochem試劑盒：人血小板肌動蛋白

窗體頂端

30-100次分析（Cat。＃BK013）

窗體底端

產(chǎn)品用途包括

· 確定蛋白質(zhì)是否與肌動蛋白的細絲或單體結(jié)合。

· 確定蛋白質(zhì)是否捆綁F-肌動蛋白

· 測試與肌動蛋白結(jié)合的各種條件（例如適pH）或要求（例如二價陽離子要求）

簡介
肌動蛋白結(jié)合蛋白降速測定試劑盒提供G-或F-肌動蛋白加陽性（α - 肌動蛋白）和陰性（牛血清白蛋白，BSA）結(jié)合對照蛋白。肌動蛋白結(jié)合發(fā)生在對肌動蛋白的任何部位具有親和力時。可以通過使用降速法測量F-肌動蛋白結(jié)合。以這種方式，離心用于通過差異沉降將F-肌動蛋白與G-肌動蛋白分離。F-肌動蛋白結(jié)合蛋白將與肌動蛋白絲共沉淀并在離心管底部形成沉淀。可以檢測具有F-肌動蛋白成束活性的蛋白質(zhì)，因為它們將導(dǎo)致F-肌動蛋白以比正常更低的離心力沉降（14,000xg對150,000xg）。F-肌動蛋白切斷蛋白，G-肌動蛋白結(jié)合蛋白或非肌動蛋白結(jié)合蛋白將留在上清液中。如果上清液中殘留的G-肌動蛋白比陰性對照樣品中的G-肌動蛋白更多，則可以預(yù)期切斷蛋白質(zhì)，并且應(yīng)該通過在添加測試蛋白質(zhì)之前和之后測量F-肌動蛋白長度分布來進一步測試該活性。G-肌動蛋白結(jié)合蛋白可以通過將測試蛋白添加到G-肌動蛋白并誘導(dǎo)聚合來測量，如果測試蛋白螯合G-肌動蛋白，那么在旋轉(zhuǎn)測定期間，與對照相比，肌動蛋白將留在上清液中。

肌動蛋白可以以兩種形式存在：球狀亞單位（G-肌動蛋白）和絲狀聚合物（F-肌動蛋白）（有關(guān)更多信息，請參見關(guān)于肌動蛋白頁面）。兩種形式的肌動蛋白都與細胞中過多的蛋白質(zhì)相互作用。到目前為止，有超過50種不同類別的肌動蛋白結(jié)合蛋白（ABP），而且?guī)齑嫒赃h未完成。肌動蛋白結(jié)合蛋白允許肌動蛋白細胞骨架快速響應(yīng)細胞和細胞外信號，并且在許多細胞過程中對細胞骨架參與是*的。這些包括細胞形狀和運動，肌肉收縮，細胞內(nèi)運輸，細胞發(fā)病機理和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

該試劑盒含有非肌肉肌動蛋白（Cat。＃APHL99）。同樣的試劑盒也可用于骨骼肌肌動蛋白（Cat。＃AKL99），參見Cat。＃BK001。骨骼肌肌動蛋白旋轉(zhuǎn)試劑盒可能更適合用于研究來自肌肉組織的肌動蛋白結(jié)合蛋白。

試劑盒內(nèi)容
該試劑盒包含足夠的材料，可根據(jù)檢測體積進行30-100次檢測。包括以下試劑：

00001. 8 x250μg非肌肉肌動蛋白（Cat。＃APHL99）。

00002. α- Actinin，陽性對照（Cat。＃AT01）。

00003. BSA，陰性對照

00004. 一般肌動蛋白緩沖液（Cat。＃BSA01）。

00005. 肌動蛋白聚合緩沖液（Cat。＃BSA02）

00006. F-肌動蛋白緩沖液。

00007. ATP，100 mM（Cat。＃BSA04）

00008. EGTA，0.5米

00009. 的MgCl ₂，100毫

00010. Tris-HCl pH 6.5,1.0M

00011. Tris-HCl pH 7.5,100mM

00012. 手冊詳細的協(xié)議和廣泛的故障排除指南

需要的設(shè)備

00001. 離心設(shè)置能夠在4°C和24°C下容量為150,000 xg，體積容量為50-200μl。

00002. SDS-PAGE系統(tǒng)。

00003. 感興趣的蛋白質(zhì)的檢測系統(tǒng)（考馬斯有利于純化的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)印跡或銀染色用于較低純度或低豐度的測試蛋白質(zhì)）。

00004. 用于光密度測定的凝膠掃描儀。

問題1：當(dāng)使用非肌肉肌動蛋白結(jié)合蛋白生物化學(xué)試劑盒（Cat。＃BK013或肌動蛋白結(jié)合蛋白生物化學(xué)試劑盒Cat。＃BK001）時，制備肌動蛋白結(jié)合試驗蛋白的*條件是什么？

答案1：  在肌動蛋白相容緩沖液（如HEPES或磷酸鹽緩沖液）中使測試蛋白質(zhì)達到盡可能高的濃度。高濃度（優(yōu)選>20μM）是優(yōu)化檢測肌動蛋白和測試蛋白之間相互作用的機會所必需的。在某些情況下，K _d肌動蛋白結(jié)合蛋白/肌動蛋白相互作用的（解離常數(shù)）可以低到不能通過顆粒的蛋白質(zhì)測定檢測到; 然而，對于肌動蛋白在反應(yīng)混合物中的影響可能足以通過沉淀和上清液中的肌動蛋白量與陰性對照的差異來檢測。我們還建議將測試蛋白質(zhì)在150,000 xg下在4°C下離心1小時，以去除變性蛋白質(zhì)和細胞碎片。如果已經(jīng)采取其他步驟（例如親和柱純化）來純化測試蛋白，則這不是必需的。高速離心后，取出上清液置于冰上。這是測試蛋白質(zhì)原料。

總離子強度應(yīng)低于50 mM，這是由于肌動蛋白結(jié)合的特性，因此它主要是離子的，因此會受到中鹽和高鹽緩沖液的影響。一個好的起始緩沖液是20 mM Hepes pH 7.4加20 mM KCl，加上蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑和任何必要的輔助因子。可以用20mM MgCl ₂和10mM ATP 制備低鹽肌動蛋白聚合10x緩沖液，從而使鹽在終反應(yīng)中保持低水平。 

需要考慮的其他問題是（i）測試蛋白輔助因子可能是必需的，（ii）測定中的因子可能是主動抑制相互作用，（iii）測試蛋白可能偏愛不同類型的肌動蛋白，或（ iv）測試蛋白質(zhì)在組織提取物中可以是低濃度的。

為了解決這些潛在問題中的一些，可以添加試劑以去除抑制劑，例如用于鈣的EGTA（部件號BSEG-01）。在運動蛋白的情況下，ATP / Mg2 +組合將使運動與F-肌動蛋白解離，因此以1mM使用不可水解的類似物如AMPPNP。肌動蛋白親和柱可用于濃縮和分離更多的測試蛋白。后，不同的pH條件可以改善肌動蛋白和肌動蛋白結(jié)合蛋白之間的結(jié)合（例如，α-輔肌動蛋白的適pH為7.0）。

問題2：非肌肉肌動蛋白結(jié)合蛋白生物化學(xué)試劑盒（Cat。＃BK013）可用于測定非肌肉肌動蛋白和肌動蛋白結(jié)合蛋白之間的結(jié)合親和力嗎？

答案2：   結(jié)合親和力（K _d）可以通過旋轉(zhuǎn)降低測定來估計，通過滴定測試蛋白質(zhì)濃度在0.2和20μM之間，并找到原始蛋白質(zhì)在顆粒中的一半的濃度。繪制百分比測試蛋白質(zhì)結(jié)合對比反應(yīng)中的原始濃度以獲得以μM計的Kd。

問題3：細胞裂解液可以與非肌肉肌動蛋白結(jié)合蛋白生物化學(xué)試劑盒（Cat。＃BK013）一起用作測試蛋白的來源嗎？

答案3：是的，細胞裂解液可用作測試蛋白的來源。然而，細胞骨架不建議這樣做，因為蛋白質(zhì)的純度和濃度通常太低而不能與肌動蛋白相互作用。此外，裂解物將含有額外的輔助蛋白和多種磷酸酶和蛋白酶，它們可以干擾或改變肌動蛋白和肌動蛋白結(jié)合蛋白之間的相互作用。如果要使用裂解物，我們建議如下：

盡管該試劑盒設(shè)計用于純蛋白質(zhì)或化合物，但一些研究人員已經(jīng)添加了具有良好結(jié)果的提取物。通常研究人員使用過表達的蛋白質(zhì)和類似過表達的野生型對照提取物。需要制備10mg / ml蛋白質(zhì)提取物，然后將其1/3體積用于1mg / ml的2/3體積的肌動蛋白。以這種方式，存在足夠高的蛋白質(zhì)濃度以指示結(jié)合。提取緩沖液應(yīng)為20mM Hepes緩沖液pH 7.4,20mM NaCl，加上蛋白質(zhì)的任何輔因子，以及蛋白酶抑制劑混合物如Cat。＃PIC02。也可加入磷酸酶抑制劑。用冰冷的緩沖液沖洗細胞，用注射器針頭或其他裝置彎曲25g裂解細胞。pH可以將肌動蛋白結(jié)合蛋白（ABP）的F-肌動蛋白結(jié)合特性改變0至100％。對于提取物制備，測試pH 6.5,7.5和8.5是個好主意。對照細胞系非常關(guān)鍵，因為潛在的ABP可能通過其他途徑出現(xiàn)在顆粒中; 例如，變性或與其他細胞蛋白質(zhì)聚集。總離子強度應(yīng)保持在50 mM以下，以免使任何潛在的ABP脫鹽。

抗體

· 概述

· 常見問題解答

Cytoskeleton Inc致力于為肌動蛋白和肌動蛋白結(jié)合蛋白提供高質(zhì)量的抗體。我們在該系列產(chǎn)品中的所有抗體均經(jīng)過QC Max™測試。已經(jīng)測試QC Max TM抗體用于蛋白質(zhì)印跡，原位和免疫沉淀。這樣，您就可以準確了解每種抗體的用途，并確保購買適合您的抗體。如果您對我們的QC Max™抗體有關(guān)的詳細信息，請點擊下面列出的產(chǎn)品以獲取更多詳細信息。

問題1：在細胞和組織中染色F-肌動蛋白的*方法是什么？

答案2：   細胞骨架提供我們的Acti染色系列熒光標記的鬼筆環(huán)肽，可在固定細胞和組織樣本中特異性染色F-肌動蛋白。Acti染色熒光鬼筆環(huán)肽探針非常明亮和穩(wěn)定，為標記F-肌動蛋白提供了一種非常簡單和經(jīng)濟的方法。鬼筆環(huán)肽用不同的綠色和紅色熒光團（Cat。＃PHDG1，PHDR1，PHDH1和PHDN1）標記。也可以使用肌動蛋白抗體，但通常那些也染色G-肌動蛋白，這產(chǎn)生高背景。

問題2：您對多克隆抗肌動蛋白抗體有何推薦稀釋度？

答案2：   抗體的稀釋度取決于所使用的細胞/組織類型和實驗形式。對于蛋白質(zhì)印跡，我們已經(jīng)測試并推薦使用濃度為500ng / ml（1：1000稀釋）的抗體。在該稀釋度下，我們在非洲爪蟾 A6細胞，小鼠Swiss 3T3細胞，大鼠NRK細胞，人HeLa細胞和血小板細胞的細胞提取物中檢測到肌動蛋白。對于免疫熒光，我們使用抗肌動蛋白抗體檢測小鼠Swiss 3T3細胞中的肌動蛋白。抗體以2μg/ ml（1：500稀釋）的濃度使用，然后與1：500稀釋的抗兔羅丹明綴合的第二抗體一起溫育。這些信息通常在圖例中或我們的抗體數(shù)據(jù)表的“產(chǎn)品用途”部分中找到。

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