Eagle Biosciences人完整成纖維細胞生長因子(FGF-21)ELISA

目錄號：

F2131-K01（1 × 96孔）

僅供研究使用。不得用于診斷程序。

v. 1.0

EagleBiosciences,Inc.

預期用途

Eagle Biosciences人完整成纖維細胞生長因子21(FGF-21)ELISA檢測試劑盒（酶聯免疫分析試劑盒）預期用于定量測定血清中人完整成纖維細胞生長因子21(FGF-21)的水平。Eagle Biosciences人完整成纖維細胞生長因子21(FGF-21)ELISA檢測試劑盒僅供研究使用，不用于診斷程序。

引言

成纖維細胞生長因子21(FGF-21)屬于FGF-19亞家族，包括FGF-19、FGF-21和FGF-23。FGF-19家族成員是調節多種生理穩態的強效內分泌激素。

完整的FGF-21是由181個氨基酸組成的小蛋白。在一系列胰島素抵抗動物模型中，給予重組FGF21可降低血糖和胰島素水平，降低肝臟和循環甘油三酯和膽固醇水平，并改善胰島素敏感性、能量消耗、肝臟脂肪變性和肥胖。FGF-21的生理功能依賴于其N末端和C末端區域的完整分子結構和氨基酸序列。N端截短的FGF-21(7-181)是一種強效抑制劑，可競爭性抑制完整FGF-21(1-181)的生物活性。因此，測量循環完整FGF-21水平在生理和病理生理狀況評估中具有重要意義。測定FGF-21片段的試驗可能高估供試品中蛋白的生物活性。

循環FGF-21是一種生物標志物，在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和肥胖患者中其水平升高。在庫欣綜合征患者、HIV-1誘導的脂肪代謝障礙患者和慢性腎病或終末期腎病(ESRD)患者中也發現循環FGF-21增加。

試驗原理

Eagle Biosciences人完整成纖維細胞生長因子21(FGF-21)ELISA檢測試劑盒的設計、開發和生產用于定量測定血清和EDTA血漿樣本中的人完整FGF-21。該試驗采用雙位點“夾心”技術和與人完整FGF-21不同表位結合的兩種選定抗體。其中一種抗體與N-末端人FGF-21(1-7)特異性結合，另一種與C-末端人FGF-21(175-181)特異性結合。

將試驗標準品、對照品和患者樣本直接加入包被抗人FGF-21(1-7)特異性抗體的微孔板孔中。同時，向各孔中加入辣根過氧化物酶結合的抗人FGF-21(175-181)特異性抗體。一個孵育期后，微量滴定孔壁上的抗體捕獲樣本中的人FGF-21，并洗去每個微量滴定孔中的未結合蛋白。形成“抗FGF-21抗體人完整FGF-21 HRP結合示蹤抗體”的“夾心”。在隨后的清洗步驟中除去未結合的示蹤抗體。為檢測該免疫復合物，將微孔與底物溶液在定時反應中孵育，然后在分光光度酶標儀中測定。與微量滴定孔壁上人完整FGF-21結合的免疫復合物的酶活性與樣本中完整FGF-21的量成正比。通過繪制吸光度與相應人完整FGF-21濃度的曲線生成標準曲線

直接根據該標準曲線測定供試品中的FGF-21。

試劑：制備和儲存

接收后，該完整成纖維細胞生長因子21(FGF-21)ELISA檢測試劑盒必須儲存在2-8 ℃下。關于試劑盒的失效日期，請參閱試劑盒包裝盒上的標簽。所有組分在失效日期前均保持穩定。

使用前使所有試劑恢復至室溫。不同試劑盒批號的試劑不得合并或互換。

1. 抗人FGF-21抗體包被微孔板

一個微孔板，含有12 x 8孔可破碎條帶（共96孔），包被有人FGF-21抗體。將板框定并密封在含有干燥劑的箔拉鏈袋中。該試劑應在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩定。

2. 人FGF-21示蹤抗體

一個小瓶含有0.4 mL濃HRP標記的抗人FGF-21抗體（穩定蛋白基質中）。使用前，必須用FGF-21示蹤劑抗體稀釋劑稀釋該試劑。該試劑應在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩定。

3. FGF-21示蹤抗體稀釋液

一個含有8 mL即用型緩沖液的小瓶。根據測定程序，應僅用于示蹤抗體稀釋。該試劑應在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩定。

4. ELISA清洗濃縮液

每瓶含30 mL 30倍濃縮液。使用前，必須用870 mL去離子水稀釋內容物，并混勻。稀釋后，得到含有表面活性劑的工作清洗液，溶于含有非疊氮化物、非汞防腐劑的磷酸鹽緩沖鹽水中。稀釋液應在室溫下儲存，并在試劑盒上顯示的失效日期前保持穩定。

5. ELISA HRP底物

一瓶含有12 mL四甲基聯苯胺(TMB)和穩定的過氧化氫。該試劑應在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩定。

6. ELISA終止液

每瓶含12 mL 0.5 M硫酸。該試劑應儲存在2-8 ℃或室溫下，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩定。

7. 人FGF-21標準品

6個小瓶分別含有不同濃度的人FGF-21，溶于凍干牛血清基質中，基質中含非疊氮化物、非汞防腐劑。各標準品的準確濃度參見小瓶。標準品可直接使用。這些試劑應在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩定。

8. 人FGF-21對照

兩個小瓶分別含有不同濃度的人FGF-21，溶于凍干牛血清基質中，含非疊氮化物、非汞防腐劑。有關各質控品的準確濃度范圍，請參見小瓶。質控品準備就緒。兩種質控品均應儲存在2-8 ℃下，并在試劑盒包裝盒上標注的失效日期前保持穩定。

安全注意事項

人完整成纖維細胞生長因子21(FGF-21)檢測試劑盒試劑必須在專業實驗室環境中使用，且僅供研究使用，不得用于診斷程序。僅牛血清試劑來源的原材料來自美國連續48個國家。僅從獸醫監督下飼養的供體健康動物中獲得，發現無傳染病。進行本試驗時佩戴手套，并將這些試劑視為具有潛在傳染性進行處理。避免接觸含有TMB、過氧化氫或硫酸的試劑。TMB可能會刺激皮膚和粘膜，引起皮膚過敏反應。TMB是一種疑似致癌物。硫酸接觸皮膚可能引起嚴重刺激。請勿接觸眼睛、皮膚或衣服。請勿攝入或吸入煙霧。接觸后，用大量水沖洗至少15 min。使用藥物非臨床研究質量管理規范。

需要但未提供的材料

· 能夠遞送25µL、50µL、100µL和1000µL的精密單通道移液器

· 重復適用于遞送100µL的分配器。

· 適用于上述體積分配的一次性移液器吸頭。

· 一次性12 x 75 mm或13 x 100玻璃管或塑料管。

· 帶蓋的一次性100 mL和1000 mL塑料瓶。

· 鋁箔。

· 去離子水或蒸餾水。

· 塑料微量滴定孔蓋或聚乙烯膜。

· ELISA多通道洗瓶或全自動（半自動）洗滌系統。

· 能夠讀取450 nm處吸光度的分光光度酶標儀。

樣本采集

僅需要50µL人EDTA血漿用于單峰人FGF-21測定。標本采集前無需對個體進行特殊準備。應使用紫色蓋的真空采血管采集全血，并通過離心（850-1500xg離心10 min）將血漿與細胞分離。應在采集后立即或至少在采血后1小時內將血漿與細胞分離。離心后應立即將血漿轉移至潔凈試管中。如果在48小時內不進行測定，血漿樣本應儲存在-20 ℃下。避免標本凍融循環超過3次。

血清樣本也可用于FGF-21測定。血清樣本采集應按照樣本采集管制造商的建議進行。

樣本運輸

收集的EDTA-血漿或血清樣本應在冷凍條件下用干冰運送至實驗室。如果冷凍條件不可用，樣本應在

冷藏運輸，例如，使用藍色冰袋運輸。

試劑制備

1. 使用前，使所有試劑恢復至室溫。不同試劑盒批號的試劑不得組合或互換。

2. 使用前，必須將ELISA清洗濃縮液稀釋至工作溶液。詳細信息請參見試劑章節。

• 向各小瓶中加入0.5 mL蒸餾水，復溶試劑盒標準品和質控品。使用前輕輕混合并溶解整個顆粒。復溶的標準品和對照品應在使用后立即儲存在-20 ℃下。
• 用FGF-21示蹤抗體稀釋劑（目錄號30600）以1:21倍稀釋結合抗體，制備工作人FGF-21示蹤抗體（目錄號30620）。下表概述了使用的試劑條與制備的抗體混合物之間的關系。

注：該抗體混合物必須在臨檢測前新鮮制備。

試驗程序

1. 將足夠數量的鼠IgG包被微孔板條/孔置于支架中，以一式兩份運行人FGF-21標準品、對照品和未知樣品。

2. 測試配置

3. 向微孔中加入50µL標準品、對照品和患者血漿/血清樣本。

4. 向各孔中加入50µL 1:21稀釋的示蹤抗體

5. 用封板覆膜覆蓋微孔板，并在室溫下通過定軌振搖170 rpm孵育微孔板2小時。

6. 取下封板膜。吸取各孔內容物。向各孔中加入350µL工作清洗液，清洗各孔5次，然后*吸出內容物。或者，可以使用自動微孔板洗板機。

7. 向各孔中加入100µL ELISA HRP底物。

8. 用封板覆膜覆蓋微孔板，同時用鋁箔覆蓋，避免暴露于光照下。平板在室溫下孵育20 min。

9. 取下鋁箔和封板膜。向各孔中加入100µL ELISA終止液。輕輕混合。

10. 在酶標儀中讀取450/650 nm下10 min內的吸光度

程序注釋

1. 建議所有標準品、對照品和未知樣品重復測定兩次。每份重復樣本的平均吸光度讀數應用于數據簡化和結果計算。

2. 將光敏試劑保存在原始琥珀色瓶中。

3. 將任何未使用的抗體包被條儲存在含有干燥劑的箔拉鏈袋中，以防止受潮。

4. 為確保試驗的重現性，必須采用仔細的技術并使用適當校準的移液裝置。

5. 除本說明書中規定的孵育時間或溫度外，其他孵育時間或溫度可能影響結果。

6. 避免微孔中出現氣泡，因為這可能導致結合效率較低和重復讀數的CV%較高

7. 所有試劑在使用前應輕輕充分混勻。避免起泡。

結果判讀

1. 計算每對重復檢測結果的平均吸光度。

2. 從所有其他讀數的平均吸光度中減去STD 1(0 ng/mL)的平均吸光度，得到校正吸光度。

3. 通過所有標準品的吸光度生成標準曲線。還可使用適當的計算機輔助數據簡化程序進行結果計算。

使用各自的校正吸光度，直接從標準曲線讀取對照品和患者樣本的人完整FGF-21濃度。

示例數據和標準曲線

顯示了人完整成纖維細胞生長因子21(FGF-21)ELISA檢測試劑盒的典型吸光度數據和所得標準曲線。不得使用該曲線代替每次試驗的標準曲線運行。

預期值

用該人完整FGF-21 ELISA測定32份正常成人血漿樣本。發現正常范圍小于200 pg/mL。強烈建議各實驗室根據正常供體EDTA血漿或血清樣本建立自己的正常范圍。

程序的局限性

1. 由于沒有可用于人完整FGF-21測量的金標準濃度，因此通過與高純度FGF-21標準品的相關性確定試驗標準品的值。

2. 對于讀數高于高標準的樣本值，建議使用稀釋液重新測定樣本。

3. 血漿標本或試劑的細菌或真菌污染，或試劑之間的交叉污染可能導致錯誤的結果。

4. 用聚酯樹脂去離子的水可能使辣根過氧化物酶失活。

質量控制

為確保結果的有效性，每項試驗應包括具有已知人完整FGF-21水平的適當對照。我們建議，除本試劑盒提供的檢測試劑盒外，所有檢測試劑盒還包括實驗室自己的FGF-21對照。

性能特征

靈敏度(LoD)

通過比20次零標準品重復測定的平均值高2倍標準差的相應OD值測定的該人完整FGF-21 ELISA的靈敏度（低）為1.7 pg/mL。

高劑量“鉤狀”效應

該試驗表明，高達20,000 pg/mL時無任何高劑量“鉤狀”效應。

精密度

通過在單次測定中測量3份供體EDTA血漿樣本（重復測定16次），驗證試驗內精密度。

通過在12次單獨試驗中一式兩份測定3份對照樣品，驗證試驗間精密度。

線性

用0.01M PBS(pH 7.4)稀釋2份人EDTA血漿樣本并進行分析。以pg/mL為單位的結果如下：

加標回收率

向兩份患者樣本中加標不同量的人完整FGF-21(1 vol. + 1 vol.)。混合物）并測定。結果單位為ng/mL，如下所示：

參考文獻

• Yie J等人FGF21 N端和C端在受體相互作用和活化中發揮不同的作用。FEBS Lett.2009 Jan 5;583:19-24.
• Micanovic R等人N-和C-末端在FGF21功能活性中的不同作用。J Cell Physiol.2009 May;219(2):227-34.
• Yusuke Murata等人FGF21作為脂質代謝的內分泌調節因子：從分子進化到生理學和病理生理學。營養與代謝雜志，2011年卷，文章ID 981315，8頁

保修信息

Eagle Biosciences,Inc.保證其產品的操作或性能基本符合其隨附包裝說明書中規定的質量標準。本保證明確限于退還任何缺陷產品的價格或使用新產品替換任何缺陷產品。本保證僅適用于買方在產品有效期內向Eagle Biosciences發出書面通知的情況。此外，Eagle Biosciences沒有義務因下列原因更換產品：a）買方疏忽、過失或誤用，b）使用不當，c）儲存和處理不當，d）故意損壞，或e）不可抗力、天災或事故。

Eagle Biosciences不作任何明示或暗示保證，除非本協議中另有規定，包括但不限于關于適銷性、適銷性、特定用途或用途的適用性或不侵犯任何知識產權的保證。在任何情況下，公司均不對任何性質的任何間接、偶然或后果性損害負責，也不對任何缺陷產品或任何產品使用造成的損失或費用負責。  未經Eagle Biosciences,Inc.事先書面批準，不得轉售、修改或更改產品進行轉售。