精z冷凍：

1.在精z冷凍保存前 4-7 天，通過交配（插頭陽性）準備 2 只雄性小鼠（>8 周齡，已證明具有生育能力）。

2.將 60μl CARD CPA 滴在 35mm 培養皿上，為每只小鼠準備 1 個精z培養皿。用石蠟油覆蓋液滴。將第二個 60μl 等分的 CPA 添加到第一滴中，制成高大的半球形 CPA 滴。在 37 ?C 下平衡（不在 CO? 中）。

3.標記每個冷凍滴管。[我們只對燈泡部分進行顏色編碼或標記。]

4.準備 Cryodropper：在培養皿中制備 90μl CARD PM 培養基，每個 Cryodropper 1 滴。在 37°C 和 5% CO? 下平衡 10 分鐘。通過移液將液滴加載到滴管中，然后輕輕地將介質輕彈到燈泡部分。輕輕擠壓燈泡以去除精z裝載區域中殘留的任何介質，并用 Kimwipe 擦去液體。在 37 oC 和 5% CO? 的條件下，將開口存放在 Eppendorf 架子中，直到上樣。

5.用 LN? 設置冷凍箱并使其冷卻。

6.標記低溫儲存瓶并預冷。[我們使用 4 毫升冷凍管并根據需要貼上標簽。每個小瓶可裝 4 個冷凍滴管。]

7.對小鼠實施安樂s。

8.去除附睪尾。將它們放在 Kimwipe 上，并在顯微鏡下*去除所有脂肪和血液。

9.將每個男性的一根附睪轉移到每個精z培養皿中。這使來自兩個男性的精z混合在精z盤中。注意：以下步驟必須快速執行；從精z釋放到冷凍總共不到 30 分鐘。

10.使用制表鉗和小角度剪刀，在每個附睪至少做 6 個切口。

11.將培養皿放在載玻片加熱器上，以 37 oC 加熱 3 分鐘。每分鐘旋轉盤子以從組織中分散精z。當組織從培養基中取出時，輕輕地從組織中擠壓剩余的精z。

12.裝載冷凍滴管：使用凝膠裝載移液器，小心地將 10μl 精z懸浮液的吸管部分裝載在中心。用熱封機密封。將加載的原型直接放在 LN2 蒸氣中的浮子上 10 分鐘。

13.將冷凍滴管轉移到小瓶中。然后將小瓶轉移到 LN 2 杜瓦瓶中并儲存在氣相中。

精z解凍：

1.從 LN? 存儲中取出 Cryodropper。

2.浸入 37°C 水浴直至解凍并孵育 10 分鐘。

3.從水浴中取出設備并用 Kimwipe 輕輕擦干。

4.用剪刀剪掉冷凍滴管的頂端，將精z滴轉移到新鮮的試管嬰兒培養皿中。

5.輕輕晃動手腕，輕輕搖動 CARD PM 介質至設備末端。[用力過猛，介質會丟失。]

6.在精z滴上涂抹培養基。[注意：如果使用試管嬰兒培養皿，則應通過外腔中的水保持濕度。如果使用普通的培養皿，精z滴應該在精z解凍前用在 CO? 培養箱中平衡的石蠟覆蓋至少 30 分鐘。]

7.在 CO? 培養箱中在 37 oC 下培養以使其容量化。[我們通常需要大約 45 分鐘。]

參考資料：

改編自 Behringer R、Gertsenstein M、Vintersten K、Nagy A. 的 B. Stone，2014 年。操縱小鼠胚胎：實驗室手冊，第 4 版。冷泉港（紐約）：冷泉港實驗室出版社。

Cryodropper-E 80010 和 Cryodropper-S 80020 

所需媒體：

• 石蠟油，(Sigma-Aldrich 18512) 
• FERTIUP 冷凍保護劑 (CPA) (Cosmobio KYD-001)（也可以內部制造，Behringer 等人，第 674-675 頁）
• FERTIUP 預培養培養基 (PM)（Cosmobio KYD-002）（也可以在內部制造，Behringer 等人，第 614 頁）

設備：

• 用于精z玻璃化的
冷凍滴管（紅線：ParaTechs 80020）• 冷凍管（4 ml）或其他合適的 LN2 儲存選項（USA Scientific 1440-9100）
• 37 ?C 的 CO? 培養箱 • 玻片
加熱器或 37 ?C 培養箱
• 水浴 @ 37 ? C （在 37°C 培養箱中加入 500 毫升燒杯水效果很好）
• 凝膠加載
吸頭（例如：USA Scientific 1022-0600）• 移液器和吸頭；例如：1ml、200ul、20ul、2ul 
• Eppendorf 架
• 帶泡沫聚苯乙烯筏的便攜式 LN? 氣相冷凍機（見下圖）